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技術(shù)文章

探針法熒光定量RT-PCR試劑盒的準(zhǔn)備工作及使用方法
點(diǎn)擊次數(shù):610 更新時(shí)間:2021-04-27
  探針法熒光定量RT-PCR試劑盒使用支原體污染PCR檢測(cè)試劑盒,能在2到3小時(shí)內(nèi)獲得可靠的結(jié)果,是一種靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速的檢測(cè)支原體污染的方法。
 
  探針法熒光定量RT-PCR試劑盒使用方法:
 
  一、樣品DNA的制備
 
  .用自選方法純化樣品的 DNA,本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)病毒 DNA 提取試劑盒兼容。也可以選購(gòu)本公司的一管式病毒 DNAout 或其升級(jí)版柱式病毒DNAout。
 
  2.如果有 N 個(gè)樣品,則需要做 N+2 個(gè)提取,包括一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照和一個(gè)陰性對(duì)照。陽(yáng)性對(duì)照是在 200μL 水中加 0μL PCR 陽(yáng)性對(duì)照作為陽(yáng)性對(duì)照,陰性對(duì)照是直接用 200μL 水作為陰性對(duì)照。提取結(jié)束后,*得到 200μL 模板 DNA(每個(gè)樣品)放冰上待用,溶解 DNA 沉淀的溶液不能少于 200μL,否則PCR 抑制物很可能會(huì)抑制 PCR。二、PCR(60 μL 體系)
 
  3.樣品管:在 N+2 個(gè)PCR 管中加入下列成分:成分 N 個(gè)樣品管 陰性對(duì)照 陽(yáng)性對(duì)照PCR MagicMix 3.0 各 20 μL 20 μL 20 μL PCR 引物對(duì) 各 2 μL 2 μL 2 μL 樣品 DNA 模板 各 8 μL - - 陽(yáng)性對(duì)照(純化后) - 8 μL - 陰性對(duì)照(純化后) - - 8 μL電泳檢測(cè)
 
  4.取 0-20 μL PCR 產(chǎn)物直接進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(本產(chǎn)品不需要單獨(dú)加loading buffer),*使用 00 bp DNA Marker,如果樣品為陽(yáng)性,將會(huì)得到長(zhǎng)度為 3582 bp 的擴(kuò)增產(chǎn)物。
 
  二、探針法熒光定量RT-PCR試劑盒的準(zhǔn)備:
 
  待各組份融化后先瞬時(shí)離心,然后輕彈混勻。按下表在已滅菌的PCR管中配制反應(yīng)體系,每次實(shí)驗(yàn)需加一個(gè)陰性和一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照,測(cè)試反應(yīng)管可以有多個(gè)。配制過程中應(yīng)注意無菌,并注意避免操作產(chǎn)生的氣溶膠造成樣品間的交叉污染,在有風(fēng)壓的設(shè)備如超凈臺(tái)或生物安全柜中進(jìn)行操作。建議配制完畢后瞬時(shí)離心以使液體沉至管底。

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